菜豆金色花叶属病毒群体遗传学、暗码子利用及进化阐发

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  浙江大学农业取生物手艺学院博士学位论文 菜豆金色花叶属病毒群体遗传学、暗码子利用及进化阐发 姓名:徐晓忠 申请学位级别:博士 专业:动物病理学 指点教师:周雪平;樊龙江 20080101 菜豆金色花叶病毒属是双生病毒中风险群体大,地舆分布广,侵染寄从多的一个属,是一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA病毒。该属病毒正在番茄、木薯、棉花 等经济做物上惹起严沉风险,形成世界农业出产的庞大丧失,因而对菜豆金色花叶属 病毒的发生、、基因组布局取功能、遗传特征、进化等方面研究已成为动物病毒 研究的热点。番茄黄化曲叶病毒是菜豆金色花叶属病毒中敏捷、风险严沉的一个 种。该病毒正在番茄上惹起黄化曲叶病,表示曲叶、叶边缘黄化、叶子变小、植株矮化 等典型症状。对中国西南部的云南和广西两省采集的双生病毒样本测序表白,中国番 茄黄化曲叶病毒正在该地域普遍存正在。 从1999到2005年正在该地域6个地址采集的16种中国番茄黄化曲叶病毒分手物, 及从GenBank数据库获得的2种该病毒分手物的全基因组序列之间的群体遗传阐发表 明,中国番茄黄化曲叶病毒的遗传多样性具有较着地区特征;分歧寄从或分歧采集时 间的中国番茄黄化曲叶病毒之间则没有较着遗传差别或遗传分化。这申明中国番茄黄 化曲叶病毒的变异遭到强烈的地舆区域选择以及相对微弱的寄从要素和时间变化的 影响。研究发觉,中国番茄黄化曲叶病毒还呈现出群体扩张的倾向和高频次的沉组现 象。对中国番茄黄化曲叶病毒基因组所有位点及编码区域进行遗传多样性阐发,发觉 非编码区域比编码区域呈现出较高遗传多样性;编码区域中非堆叠区域比堆叠区域呈 现出较高遗传多样性。这申明该类病毒的非编码区域以及编码区域的非堆叠区域遭到 选择压力较弱,可能是突变的热点区域。对ACI侧翼序列(IR2)和AV2侧翼序列(LRl) 两区域的多样性阐发表白,非编码区域IRl和IR2部门正在统一病毒内或分歧病毒之间 存正在着潜正在的分歧脚色和功能。 对菜豆金色花叶属病毒编码基因暗码子利用变异阐发表白,菜豆金色花叶属病毒 的暗码子用法除遭到碱基突变偏性影响外,还遭到选择压力等其它要素的影响。但进 一步研究发觉,概况上受选择压力影响很大的AC4基因现实上是由ACl基因的碱基 突变偏好所惹起,而不是由选择压力所形成。由此猜测碱基突变偏性是菜豆金色花叶 属病毒暗码子利用模式发生变异的次要缘由。对菜豆金色花叶属病毒编码基因的碱基 构成阐发,表白AVl()和BVI基因具有较强的暗码子利用偏好和较高的基因表达 程度,此中AVI基因正在A(T)和G(C)之间没有出格较着的利用偏好,但正在A和 T之间却较着偏好利用以T结尾的暗码子。以AVI(V1)基因做为参考集,最初确定 14个暗码子做为菜豆金色花叶属病毒的次要偏心暗码子。分歧寄从菜豆金色花叶属病 毒的暗码子利用模式阐发表白,菜豆金色花叶属病毒对番茄寄从的顺应能力强,而对 木薯、胜红蓟等其它寄从的顺应性相对较弱。此外,菜豆金色花叶属病毒的暗码子使 用模式和病毒侵染后发生的症状无关。从菜豆金色花叶病毒属中单组份旧世界病毒和 双组份新世界病毒正在暗码子利用模式上的较着区别,猜测新世界病毒可能由单组份的 旧世界病毒颠末双组份的旧世界病毒再进化而来的。菜豆金色花叶属病毒和其它双生 病毒的暗码子利用比力阐发表白,除玉米线条病毒属外,其它双生病毒和菜豆金色花 叶属病毒一样具有不异的暗码子利用模式。双生病毒各属中具有不异功能基因具有相 似的暗码子利用模式,暗示动物病毒的暗码子用法也具有必然的功能寄义。凡是票据 叶动物的暗码子用法较着分歧于双子叶动物。对应阐发和聚类阐发成果均表白侵染单 子叶动物和侵染双子叶动物的双生病毒之间的暗码子使器具有较着差别。这申明双生 病毒的暗码子利用模式还遭到寄从基因的影响,具有必然的寄从性。 环节词:双生病毒;遗传多样性;暗码子用法;系统发育阐发:进化 Abstract Begomovirus arethe genus majoritymembersinthe family Geminiviridaewith widedistributionandhost range andcausemanydiseases.Begomoviruses havecircular single.strandedDNA(ssDNA)genomesencapsidated withintwinned particles.Because theseveredamagetoimportantcropssuchastomato,cassava andcottoninthe world,and correspondinghugelossesof agriculturalproduction,the occurence,transmission, genome structureand function,genetic characteristicsandevolutionof begomoviruses have been becoming ahotresearch field.Tomato yellow leafcurl virus(rvtCv)in BegomovirusgenusspreadveryrapidlyintheWorldandcausedevastating diseasesin tomato.TYLCVcausestomato yellow leafcurl diseases(TYLCD)with visual symptoms suchas curling,yellowing andreductionoftheleavletsarea together stuntingandSO on.Anumberof begomovirus isolateshavebeencollectedfromYunnanand Guangxi provinces insouthwestofChinaandseqenceanalysis indicatedTomato yellow leafcurl China virus(TYLCCNV)occurredwidely inthese regions. Thecomplete nucleotide sequences ofsixteenTYLCCNVisolatescollectedfromsix sitesintheYunnanand Guangxiprovinces southwestofChinafrom1999to2005,together withothertwoisolates GenBankwereusedinour population genetic investigation.Thephylogeneticanalysis oftheTYLCCNV18isolates stronglysuggested geography—relatedgeneticvariationor diversity.Nosignificant genetic variation diversitywasdetected among TYLCCNVisolatescollectedfromdifferenthostsordifferent times.Theresults suggest geographicalselection force playsimportant role TYLCCNVevolutionwhilehostandtimehaverelativeweakeffect.Moreover,occurrenceofTYLCCNV populationexpansions andthe hi曲frequency ofrecombination among TYLCCNVgenomes wasalso documented.Theintraspecific genetic diversity TYLCCNVwasalsoexaminedatallsitesfor genomes andtheir codingregions。It foundthatthehighgeneticdiversity waslocatedat non—coding non-overlappedcodingregions,rather than coding overlappedcodingsequences.Thegeneticdiversitypatternindicatedthat theselective constraints(orpressures)were lowerin non—coding mightbecomethe potential mutation hotspots.The analysis geneticdiversitybetweenthetwo intergenicregionsflankingACl potentialdifferentrolesorfunctionsbetweenthem. The analysis oncodonusagesuggestedthat,apart frombasemutationbias,otherfactorssuchas selection pressuremight also play arolein shaping thecodon usage biasofbcgomoviruses Further analysis indicatedthatthecodon usage ofAC4 genes actuallyshapedbythebase mutationbiasderivedfromAC/genes,not determinedvisuallyby theselection pressures Taken togetherit synonymouscodon usage variation basemutation bias.Analysis onthebase composition ofthe begomovirusgenesshowedthatthetwo genesof么耽(聊)andB班had relatively strongersynonymous codon usage biasand higherexpression level.Italso showedthat AV/gene didn’t tendtouse A-ending Or G(C).ending codons howevertendedtouseT-ending codonsin comparison A-endingcodons.Thus,14codonswere finally determinedas optimal oneswith regard tothe higherexpressiongenes AV/(vo asareference set.Analysis ofthecodon usagepatterns differenthostssuggested begomovirusesinfectedtomatomoreadaptively thanother hostssuchascassavaand ageratum.Furthermore,therewasnocorrelationbetweenthe synonymous codon usagepanerns geminivirusesandthe appearedsymptoms correspondinghostsafter being infccted.Inaddition,the apparent differencesofthecodon usagepatterns betweentheOldWbrld monopartite virusesandtheNewW|orld bipartite viruses,indicatedthattheNewW.orld bipartite viruses probably evolvedfromthe0ld Wb订d bipartiteones,whichwereevolvedfromthe01dWbdd monopartiteviruses.T1le comparativeanalysis between begomoviruses andotherthree genera geminivirusessuggested apartfromthe genusMastrevirus,othergeminiviruses hadthesamecodon usagepatterns.Inaddition,thefunction—alike genes fromdifferent genera geminivirusesalsohadthesimilar patterns ofcodon usage,which indicatedthecodonusageof plant viruseshadacertain functional implication.Ingeneral,monocots anddicots have distinguishable codon bias.Correspodenceanalysis andcluster analysis basedoncodon usage indicesalsoindicatedthatthemono-and dico.infectionggeminiviruseshadthe apparent variationsincodon usage.ne results suggested thatthe synonymous codon usage paaerns ofdifferent geminiviruses werealsoinfluenced theenvironmentwheretheirhosts stayshowing acertainextentof host specific. Keywords:geminiviruses;geneticdiversity;codonusage;phylogeneticanalysis;evolution 称谢本论文是正在导师周雪平传授和樊龙江传授的配合指点下完成的。本研究从选题、 尝试内容构想到论文写做和点窜,无不凝结着两位导师的心血和聪慧。周教员孜孜不 倦工做的忘我、严谨治学立场的摸索、远瞩学科成长的独创是我今 后不竭进修效仿的方针。周教员正在学术研究上的认实结壮、正在待人接物上的温雅宽大旷达 给我留下深刻印象,并使我受益一生。而樊教员那吃苦研究、勤于思虑,长于接管新 理论、新方式,怯于立异、怯攀科学高峰的也同样是我此后的进修典型。樊教员 展示出一种积极向上、怯于开辟、严谨治学、不断改进的阳光,时辰我不竭 向前进。总之,六年来获得导师的上行下效,使我正在人生道上深受鼓励、获益匪浅。 正在论文完成之际,谨此向两位导师表达我晟高尚的和衷心的感激。 我出格要感激农学院的坡博士,恰是正在他的帮帮下,我才能较快地开展我的 研究工做。无论正在课题研究内容和方式选择上,仍是正在论文写做和点窜上,士都 赐与了极大帮帮和热情指点,供给了很多贵重经验和。 衷心感激李桂新教员和谢艳、施曼玲博士对我学业上的关怀和帮帮。感激吴剑丙 小师傅对我尝试手艺上的经验教授。感激青玲、江彤、郭维、叶剑、郭小建等正在尝试 过程中的交换及供给的贵重看法。衷心感激病毒尝试室的所有兄弟姐妹们正在工做、学 习中赐与的支撑和帮帮,正在和大师一路进修、做尝试的日子里,使我亲身感遭到团队 合做开展进修和科研的空气取魅力,也使我俄然感应即将分袂后的伤感。 感激单元带领和同事对我学业上的支撑和帮帮。恰是单元带领的理解和支撑,才 使我有这么长时间退职进修,也恰是同事们为我承担了更多的工做,才使我有精神专 注于结业论文的研究和撰写工做。 感激我的家人和亲朋,出格是我爱人赵亚萍密斯对我学业上的深深理解和鼎力支 持。他们的奉献和关怀激励才使我有更多精神和丰满热情投入到进修科研中并顺 利完成学业。 2008年1月于杭州华家池浙江大学博士学位论文 第一章文献综述 第一节双生病毒研究进展 1双生病毒的发生和风险 经济全球化,交通、旅逛、农产物商业等人类勾当的日益屡次,全球天气变暖以 及耕做轨制、农业生态的改变为双生病毒长距离迁移、扩散和大面积迸发创制了 有益前提。目前,双生病毒已普遍发生于亚洲、非洲、欧洲、南美的加勒比海岸及北 美的墨西哥和美国等世界各地。至多有39个国度的棉花、木薯、番茄、烟草等做物 已蒙受该类病毒的性风险,给本地农业出产形成了庞大丧失’(Moriones& Navas.Castillo,2000)。好比,1990年多米尼加95%的番茄遭到双生病毒的; 1991.1992年该类病毒正在美国佛罗里达州的番茄上形成丧失达1.4亿美元(Moffat, 1999;MorionesNavas.Castillo,2000)。1992.1997年,棉花曲叶病毒导致巴基斯坦 200多万公顷棉田,形成丧失达50亿美元(Briddonetal.,20002001);非洲木薯 每年因双生病毒风险的丧失也达13~23亿美元(Thresheta1.,1998)。 上世纪八十年代初,龚祖埙等(1982)通过电镜察看到烟草曲叶病毒孪生颗粒的 存正在,了双生病毒正在我国的发生。但那时双生病毒正在我国发生范畴小、风险轻, 并未惹起人们的注沉。而从90年代起,正在我国云南、广西、广东、海南等地的烟草、 番茄、番木瓜和南瓜等多种做物上接踵发生双生病毒的风险并呈逐年加沉趋向(洪益 国等,1994a,b;刘玉乐等,1998;谢艳等,2001;Zhou et a1.,2001a,b;XieZhou, 2003)。正在云南,双生病毒惹起的喷鼻料烟曲叶病正在局部田块病株率达70%以上,惹起 烟草产量、质量的严沉丧失。而正在广西的番茄和番木瓜上,双生病毒发病也很遍及, 发病严沉地域病株率高达30.50%,有的田块以至100%植株染病,丧失惨沉。近几年, 双生病毒正在上海、浙江及江苏发生也很遍及。 因为双生病毒的普遍发生和风险形成全世界农业出产的庞大丧失,对双生病毒的 浙江大学博士学位论文 发生、、基因组布局取功能、遗传变异、进化等方面研究已成为动物病毒研究的 2双生病毒的特征取分类双生病毒是动物病毒中一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA病毒。病毒粒子为 双联体布局,颗粒大小约为18nm30 nm,无包膜(图1.1)。病毒基因组为单组份或 双组份,大小为2.5~3.0kb。次要发生正在热带、带地域,温带地域偶有发生。正在 天然前提下,双生病毒一般由虫豸介体以持久性体例,大多侵染寄从动物的韧皮 部组织(HarrisonRobinson,1999)。 图1.1双生病毒的孪生颗粒形态布局图 Fig.1.1 Twinnedisometric morphology geminivirusparticles双生病毒正在病毒分类上属双生病毒科(Geminiviridae)。按照双生病毒基因组布局、 介体和寄从范畴的分歧,国际病毒分类委员会(IC)将双生病毒科划分为四个 属,即玉米线条病毒属(Mastrevirus)、甜菜曲顶病毒属(Curtovirus)、番茄伪曲顶病 毒属(Topocuvirus)和菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)(Pringle,1999;Fauquet et aI.,2003)。 2.1玉米线条病毒属(Mastrevirus) 该属代表种为玉米线条病毒(Maizestreakvirus,MSV),为单组份病毒,基因组 大小为2.6.2.8kb,含4个阅读框(ORFs),病毒链编码II/(外壳卵白,CP)和 112(挪动卵白,MP),互补链编码C1(复制相关卵白,RepA)和C2(RepB)。(7/ 浙江大学博士学位论文和陀及c2和之间别离由大、小两个非编码区(1argeintergenicregion.LIR;small intergenicreon,SIR)离隔(图1.2)。LIR含有双生病毒复制起始所必需的9碱基保 守序列“TAATATT/AC’’和其它顺式感化元件。除了玉米线条病毒以外,该属所有病 毒的RepB均贫乏甲硫氨酸起始暗码子(ATG)。别的,该属所有病毒的Rep基因均含 有一个内含子,玉米线条病毒及其它侵染草本动物病毒的MP基因(V2ORF)也含有 一个内含子(Rybicki,1994)。 LIR 图1。2玉米线条病毒属的基因组布局 Fig.1.2 GenomicorganizationofMastrevirus 该属病毒天然寄从范畴窄,绝大大都局限于禾本科动物,只要烟草黄矮病毒 (TYDV)和菜豆黄矮病毒(BeYDV)侵染双子叶动物。正在禾本科动物上惹起叶片条 斑、植株矮缩等症状,正在双子叶动物上惹起叶片黄化、植株矮缩等症状。正在天然前提 下,通过叶蝉(Eutettixtenellus)以持久性体例。该属病毒现有12个种和2个暂 定种,分布于非洲、印度、日本、等地域。该属中的小麦矮缩病毒(wDV) 已正在我国发觉。 2.2甜菜曲顶病毒属(Curtovirus) 该属代表种为甜菜曲顶病毒(Beetcurlytopvirus,BCTV),为单组份病毒,基因 组大小为2.9.3.0k6,一般病毒链及互补链共编码6"--'7个ORFs。如甜菜曲顶病毒加 利福尼亚/洛根株系共编码7个ORFs(图1.3),此中3个正在病毒链上(VI-'.V3),4 个正在互补链上(C1---C4)。病毒链上订ORF编码的外壳卵白(CP)涉及病毒的包拆 浙江大学博士学位论文的挪动,I/2ORF的编码卵白调理基因组的ss/dsDNA程度,坊产品涉及病毒的活动; 互补链上171 ORF编码复制相关卵白(Rep),C2 ORF编码的产品雷同激活卵白 (TRAP),C3ORF编码复制加强卵白(REn),C4ORF编码产品是主要的症状决定因 子,也取病毒的胞间挪动相关(HormuzdiBisaro,1995;Lathameta1.,1997)。 IRC3 图1.3甜菜曲顶病毒属的基因组布局 Fig.1.3 GenomicorganizationofCurtovirus 该属病毒寄从范畴较广,能侵染44个科的300多种动物。寄从均为双子叶动物, 受侵染后一般发生明脉、卷叶、叶脉隆起、叶子概况粗拙不服、叶背发生小耳突等症 状。正在天然前提下,通过叶蝉(Eutettixtenellus)以持久性体例。该属病毒现有2 个种和1个暂定种,分布于西洲从墨西哥到的干旱和半干旱地域,东地中 海流域可能是病毒的发源地。我国已有报道。 2.3番茄伪曲顶病毒属(Topocuvirus) 番茄伪曲顶病毒(Tomatopseudo.curlytop virus,TPCTV)是番茄伪曲顶病毒属的 代表种,也是该属独一的一个种。为单组份病毒,基因组大小为2861bp,正在病毒链 和互补链上共编码6个ORF。此中2个正在病毒链上(V/"-V2),V/ORF编码外壳蛋 白(CP), V2ORF编码挪动卵白(MP);4个正在互补链上(C1"--C4),基因组布局类 似于甜菜曲顶病毒属病毒(BdddonBedford,1996)。 番茄伪曲项病毒寄从范畴较窄。寄从为双子叶动物,受侵染后一般发生明脉、叶 片上卷或下卷、叶脉隆起、褪绿等雷同于甜菜曲顶病毒惹起的症状。该属病毒是双生 病毒中独一通过树蝉(Micrutalismalleifera)以持久性体例的病毒,分布于美国 浙江大学博士学位论文佛罗里达南部地域。 2.4菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus) 该属代表种为菜豆金色黄花叶病毒(Beangoldenyellow mosaicvirus,BGYMV), 大大都为双组份病毒(bipartiteviruses),含有2条大小为2.5~2.8kb的DNA, 即DNA-A和DNA-B(图1.4);少数为单组份病毒(monopartite viruses),基因组只 含有大小为2.8kb的一条DNA,雷同于双组份病毒中的DNA-A(Lazarowitz, 1992)。 按照双生病毒的进化关系,又可将菜豆金色花叶属病毒分为新世界病毒(New Worldviruses)和旧世界病毒(OldWorldviruses)。~般将分布于亚洲、非洲、欧洲和 地中海地域的病毒称为旧世界病毒;分布正在美洲地域的称为新世界病毒。新世界病毒 凡是曾经进化为双组份病毒,旧世界病毒中有些为双组份病毒,有些则为单组份病毒 (Harrison&Robinson.1999)。 图1.4菜豆金色花叶病毒属的基因组布局 Fig.1.4 Genomic organization Begomovirus无论双组份病毒仍是单组份病毒,菜豆金色花叶属病毒的DNA.A一般都倾向于 编码6~7个ORFs(图1.4),此中所有病毒都含有病毒链上编码的AVl和互补链上编 码的ACI、Ac2、AC3共4个ORFs。AVlORF编码的病毒外壳卵白(Coat protein, 浙江大学博士学位论文CP)次要参取病毒粒子的包拆,还取介体传毒、系统侵染和取寄从互做相关(Zhang et a1.,2001;Harrison&Robinson,2002)。AC/ORF编码的复制相关卵白 (Replication.associatedprotein,Rep)次要涉及病毒的复制、起始病毒链DNA的合 成(Laufseta1.,1995)。AC2 ORF编码的激活卵白(Transcriptional activator protein, TrAP)可调理DNA-A和DNA-B(如有)病毒链上各个基因的(SunterBisaro, 1991;Sunter&Bisaro,1992)oAC3ORF编码复制加强蛋t兰t(Replication enhance protein, REn)并不是病毒复制所必需,但能通过取ACI的互做来加强病毒的复制效率。 有些ORFs1/2和AC4)并不存正在于所有菜豆金色花叶属病毒中。AV2ORF只 存正在于旧世界病毒中;而新世界病毒中则没有发觉,所编码的CP前体卵白,取病毒 的活动相关(Padidamet口f.,1996)。大大都菜豆金色花叶属病毒都含有AC4ORF,且 AC4嵌合于ACl中,AC4正在含DNA.B的双组份病毒中不起感化,正在只含DNA-A的 单组份病毒中取病毒的活动和/或症状构成相关(Rigden et a1.,1994;Jupin et a1., 1994)。 有些菜豆金色花叶属病毒还可能含有其它ORF。例如印度新德里番茄曲叶病毒 (Tomato leafcurl NewDelhivirus,ToLCNDV)的DNA-A病毒链上含有AV3,但AV3 缺失后不影响病毒的复制、活动及症状构成,猜测AV3ORF可能并不编码卵白 (Padidamet a1.,1996)。 双组份菜豆金色花叶属病毒的DNA-B共编码2个ORFs。病毒链上的BV/ORF 编码核穿越卵白(Nuclearshuttle protein,NSP),取病毒DNA正在细胞核取细胞质之间 穿越运输相关。互补链上的BC/ORF编码的挪动卵白(Movementprotein,MP),用 以调理病毒的胞间挪动和长距离运输。只要通过BV/和BCl编码卵白的彼此协调配 合才能实现病毒正在寄从动物中的活动(Sanderfoot&Lazarowitz,1995;Harrison Robinson,1999)。 正在DNA.A的AV2(以前称AV/)和AC/之间以及DNA-B的BV/和BC/之间均 含有一个约200-。400bp的非编码区,称为间隔区(intergenicregion,IR)。虽然DNA-A 和DNA.B的序列差别很大,但二者瓜区的序列却很是保守,同源性往往高达95% 以上,所以IR区又称为配合区(commonregion,CR)。IR区含有复制和所必需 的元件,包罗位于中部的上逛激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)和位于 两头的双向启动子序列。上逛激活序列中含有一个茎环布局,分歧菜豆金色花叶属病 浙江大学博士学位论文毒的茎部序列会有差别,但正在茎环地方一直存正在保守的九核苷酸序列(TAATATTl AC),I后的碱基A是病毒基因组复制的起始原点(Lazarowits,1992;LaufsetaL,1995; Stanley1995)。茎环布局的上逛一般含有两个TATA盒序列,可能是病毒链和互补链 的起始位点。茎环布局上逛还含有2~3个反复序列,称为反复子(iterons),长 约6"-'12 bp。反复子是病毒复制相关卵白(Rep)的连系位点(Arguello-Astorga eta1., 1994a,b;Fontes et a1.,1994a'b)。 该属病毒寄从范畴广,正在天然前提下侵染双子叶动物,寄从动物几乎涵盖高档植 物各个科。寄从受侵染后一般发生叶片黄化、曲叶、花叶、黄脉、明脉、叶脉增厚、 叶背发生耳突、植株矮化等症状。正在天然前提下,一般通过烟粉虱(Bemisiatabaci) 以持久性体例,该属病毒因此也称粉虱传双生病毒(whitefly.transmitted geminivirus,WTG)(HarrisonRobinson,1999)。该属病毒现有102个种和48个暂 定种,普遍分布于热带及带地域,正在美洲、非洲、亚洲及地中海地域均有报道, 曾经成为世界性分布的病毒。我国正在云南、广西、广东、海南省的烟草、番茄、南瓜、 番木瓜及杂草(赛葵、稀硷、胜红蓟、假马鞭)上已发觉了多种菜豆金色花叶属病毒。 3双生病毒的遗传和变异 病毒往往能成功地顺应新的生态以保留本人,并最终形成病毒风行以至大爆 发(Goldbachet a1.,1994;Morales et a1.,2001)。近年来,人们对RNA病毒群体做了大 量深切详尽的遗传阐发研究,但对DNA病毒群体遗传方面的研究还很缺乏(Arandaet 口己,1993;Clarkeet口L,1993;Rodriguez-Cerezoetal.,1991;Sanzet口正,1999)。因为内正在 特征和侵染过程分歧,RNA病毒和DNA病毒可能具有分歧的遗传进化驱动力。 动物DNA病毒的复制既有花椰菜花叶病毒那样通过反过程进行复制,又如 双生病毒那样依赖于寄从动物细胞核中DNA聚合酶来复制(Hanley.Bowdoin et aL, 1999;Gutierrez etaL,2004)。按照所猜测反酶的高错配率,Blanc(2003)检测到 花椰菜花叶病毒的高突变频次(Blanc,2003)。可是,正在依赖于切确度很高的寄从DNA 聚合酶的双生病毒中也检测到了高突变频次(1snard et a1.,1998)。研究测定番茄黄化 益叶病毒的总突变频次为10104,而动物RNA病毒测定的突变频次别离是:烟草 花叶病毒为10.2lO(Rodriguez.Cerezoet口正,1989);烟草花叶病毒的卫星为 11.310 (Kurathet aL,1992);烟草花叶病毒的外源序列复制为3.9.22104 (Kearneyet口fI,1993)。对中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)的研究表白, 浙江大学博士学位论文TYLCCNV侵染本氏烟(Nicotianabenthamiana)和番茄(Solanumlycopersicom)60 天后,经取寄活泼物互做后,该病毒构成了一个以接种序列为从导序列,伴跟着很多 取从导序列存正在细小差别的次要序列的种群布局,这各种群布局雷同于RNA病毒的 “准种”;其变异频次堆集达104,取已报道的动物RNA病毒具有可比性(Geeta1., 2007)。可见,双生病毒和动物RNA病毒一样,也具有高突变频次。这种高突变频次 可能取病毒复制后的修复缺失相关(Sanzet a1.,1999)。雷同准种的种群布局了双 生病毒具有高度的进化潜力,以顺应不竭变化的农业实践。 研究发觉,双生病毒的lR区和C4ORF具有高突变频次,而V/、(7/和V2ORFs 则很少发生变异,而a具有较高的同义突变。这和iT/ORF是独一编码复制相关蛋 白相关(Desbiezet a1.,1995),而I//ORF则参取胞问挪动的侵染过程。正在天然前提下, 为连结病毒种群的不变性,一般同义突变发生得比力多(Sanzetal.,1999);而对于病 毒非同义突变则次要倾向于无布局或功能域序列中的突变堆集。 此外,沉组事务已成为双生病毒进化的无效路子(HouGiVe.son,1996;Padidam 甜a1.,1999;Pitaetal.,2001;Sanzetal.,2000)。.研究表白,双生病毒田间群体的品系间 变异程度遭到了(Sfinchez.Campos eta1.,2002)。对菜豆金色花叶属病毒的研究也 发觉,当缺乏取其它品种(系)发生沉组,双生病毒品系之间的变异程度会遭到较着 (Gilbertsonet aL,1991;Stenger&McMahon,1997;Faria&Maxwell,1999)。对于 动物病毒群体来说,其正在遗传上的不变性要比多样性更具有纪律性,而不管其能否为 RNA或DNA病毒。这种病毒群体的低遗传多样性可能是其扩散到某个寄从或地域后 陪伴群体瓶颈呈现的鼻祖效应所惹起的(Novellaeta1.,1995)。对卵白质编码序列的 选择感化了该类病毒的遗传多样性(Sanzetal.,1999)。此外,非编码区域(m) 和非功能区域的突变堆集申明选择感化对于病毒布局功能维持具有主要感化。撒丁尼 亚番茄黄化曲叶病毒(TYLCSV)群体中也同样呈现遗传多样性的现象 (S:inchez.Camposet口正,2002)。正在动物病毒中这种对核苷酸变异的比力遍及,正在 棉花曲叶病毒(CLCuV)中的非编码区和编码区的非同义位点也发觉雷同环境(Sanz 改口f.,1999)。正在TYLCSV群体中没有发觉有地区特征,暗示其具有并未呈现较着分 化的病毒群体。正在阐发时间段内,TYLCSV也没有呈现大的遗传多样性现象 (S细chez-Campos et口f.,2002)。 总之,目前对于双生病毒遗传变异方面研究还很少,这也碍于病毒序列材料的缺 乏。近年来,跟着越来越多的双生病毒序列被测定,开展双生病毒的遗传变异研究, 特别对病毒群体遗传变异研究就成为可能,很多问题也有待更深切研究和摸索。 浙江大学博士学位论文第二节病毒暗码子利用研究进展 遗传暗码指DNA或mRNA中的核苷酸序列取其所编码卵白质中氨基酸序列之间 的对应关系(Gamow1954),包罗61种编码氨基酸的有义暗码子和3种凡是不编码任 何氨基酸的终止暗码子(UAA、UAG和UGA)。遗传暗码具有通用性,生物界从最 低等的病毒曲至人类几乎共用统一套遗传暗码(表1.1)。虽然还有少少数反常暗码子 的存正在(王卫建,1989;陈尚武等,1992;付月君等,2004),好比人类线粒体中通用密 码子AUA(异亮氨酸)和UGA(终止暗码子)别离编码甲硫氨酸和色氨酸;而编码精 氨酸的暗码子AGA和AGG贝JJ成为终止暗码子等等(Barrelleta正,1979),但通用遗传 暗码这种根基特征已获得很多研究者的遍及认同,也成为现代生物学的理论基 表1.1通用遗传暗码表Table1.1Listof genetic codes 暗码子的第二位 UUUUCU ;PheTyr, 、,Cys‘ UUC UCC UAC。 UUAUCA UAA Stop UGA Stop LeuUUG UCG UAGStop UGG Trp CUUCCU CAU CGU HisCUC CCC CAC LeuPro Arg 暗码子 CUA CCA CAA CGA 暗码子GlIl 的第一 CUG CCG CAG CGG ACUAAU AGU AsnSet AUC Ile ACC AAC AGC Thf,7fj一。,,f, ACAAAA LysArg AUG Met ACG AAG AGG GUUGCU GAU GGU AspGUC GCC GAC GGC ValAIa Gly GUA,。 GCA GAA,GGA .,sA G1U GUG GCGGAG GGG 浙江大学博士学位论文子称为同义暗码子(synonymouscodon)。正在卵白质合成过程中编码氨基酸的同义暗码 子并不被随机利用,某一或某一基因往往倾向于利用一种或几种特定的同义暗码 子,这种现象被称为暗码子利用偏性(codon usagebias)。研究表白,分歧或统一 的分歧基因都具有较着的暗码子利用偏性(Wain.Hobsonet a1.。1981; Ikemura,1985;Sharp eta1.,1988;Levineta1.,2000;Gu et a1.,2004;Adamseta1.,2003; Zhouet a1.,2005)。生物体暗码子利用偏性具有很大的性,同时也遭到其它 诸多要素的配合影响,因而对某个基因组暗码子利用偏性做出完整地注释就显得十分 坚苦。研究人员也往往考查单个要素对于暗码子利用偏性的影响,而很少将各影响因 素联系起来进行分析阐发。研究发觉,暗码子利用偏性次要遭到突变偏性(Lcvineta1., 2000;Jenkins et a1.,2001,2003;Houet口互,2003)、翻译选择(Sharp et a1.,1991;Ghosh et 口正,2000;Gupta et a1.,2001;Peixoto et a1.,2003;Romero et a1.,2003)、卵白质二级布局 (Oresicet a1.,1998;Chiusano et a1.,2000;Gupta et a1.,2000;D’Onofdo et a1.,2002)、复 制和选择(Mclnemey1998;Romero et a1.,2000)、mRNA的二级布局(Zama,1990; Guet a1.,2004)、基因长度(Eyre.Walker1996;Moriyamaet口f.,1998;Stoletzkiet以, 2007)、tRNA的品貌(Rocha,2004;Buchanet a1.,2006)以及外部(Lynn et a1.,2002; Basak et口正,2004;VanderLindeneta1.,2006;江澎等,2007)等要素的影响。

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